罗 伟 孙建军
(北京海军总医院耳鼻喉科，全军耳鼻咽喉科中心 邮编：100037)
外周听觉系统病变常导致程度不同的感音神经性聋，一向被认为是耳科的难治之症。由于感音神经性聋的发病机制目前尚未明确，其致病因素和临床表现形式的多样性使得治疗上难以获得确实有效的方案，近来，随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的发展，已开始出现某些具有重要意义的进展，为最终解决这类问题带来了希望。近10年来随着神经生物学研究的进展，对于多肽类营养因子与听觉神经系统间相互关系的认识不断深入，神经营养因子(neurotrophic factors，NTF)对外周听觉系统作用的研究已证实其不仅是听觉上皮、听觉神经元细胞发育、成熟、增殖分化、存活的必需因子，而且对损伤后修复、残存神经元的存活和功能可塑性有重要作用[1-3]，外源性神经营养因子对听觉上皮和听觉神经元的保护作用已在耳毒性药物和声损伤的动物模型中得以证实[4-8]。基因工程技术的进展已能构建特异性载体，并能携带神经营养因子基因导入动物耳内，在动物内耳获得高效表达，产生具有高度生物活性的稳定的基因产物[9-11]，这为基因治疗感音神经聋提供了生物学证据。基因治疗在感音神经聋的防治中具有重要的理论意义和应用价值。
内耳组织结构特点与发育神经生物学
一、哺乳动物内耳解剖特点
哺乳动物和人类的内耳分为骨迷路和膜迷路，骨迷路由致密的骨质组成，包括前庭、骨半规管、耳蜗；膜迷路借纤维束固定于骨迷路内，膜迷路含有内淋巴，膜迷路和骨迷路之间充满外淋巴，内、外淋巴互不相通；耳蜗的骨性蜗管内有3个管腔：前庭阶、中阶、鼓阶，中阶属膜迷路，前庭阶和鼓阶的外淋巴经蜗孔相通，鼓阶由圆窗膜封闭；中阶的下壁有基底膜，听觉感觉受器Corti器位于其上。耳蜗内的液体（内、外淋巴）流动能易化颗粒的扩散，很快到达整个耳蜗；由于血迷路屏障的存在，与其它器官相比，内耳与身体其它部分是相对隔离的。
二、内耳发育神经生物学
近年来耳神经生物学的研究发现外周听觉神经系统的生长发育与神经营养因子间有着密切的关系。神经营养因子是指一组能支持神经元发育与存活的小分子多肽，与外周听觉系统关系密切的神经营养因子主要有脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic growth factor，BDNF）、神经营养素-3（neurotrophin-3,NT-3）、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophin factor,GDNF)等。BDNF可由耳蜗感觉上皮的已分化细胞或前体细胞合成，并以旁分泌或自分泌形式作用于听觉系统，内耳感觉上皮细胞有BDNF的高亲和力受体trkB mRNA表达，并与BDNF表达的时间特点相适配。NT-3在内耳Corti器有表达，在发育和成体的内耳为最重要的存活因子，编码NT-3高亲和力受体trkC mRNA表达主要分布于螺旋神经节的分化区域[12]。BDNF和NT-3在听神经元的正常发育及功能维持中发挥重要作用，NT-3基因突变可引起I型听神经元缺失，BDNF基因突变可引起II型听神经元缺失[13]。GDNF家庭成员包括GDNF、neurturin、artemin、persephin，其受体有GFR-1、GFR-2、GFR-3和c-Ret亚单位。GDNF在全耳蜗、蜗轴、感觉上皮/侧壁表达强度水平相等，GDNF的高亲和力受体GFR-1在耳蜗各种组织中表达均较高；neurturin及其高亲和力受体GFR-2、artemin和其高亲和力受体GFR-3在全耳蜗、感觉上皮/侧壁表达均提高，虽然artemin在蜗轴表达较低，但GFR-3在蜗轴中表达较高，persephin在三种耳蜗组织（全耳蜗、蜗轴和感觉上皮）中均有表达，且检测到328bp和240bp二种扩增产物；受体复合物的c-Ret亚单位在耳蜗中有表达[14]。
三、神经营养因子与外周听觉系统
在外周听觉系统中，神经营养因子能促进前体细胞分化，维持神经元存活与分化，促进神经突起生长，对传入神经纤维成熟和维持功能有重要作用，增强损伤后的修复、神经元的可塑性。NTF的体内作用形式为靶源性，只有得到靶源性因子作用的神经元能得以存活，缺乏靶源性因子支持的神经元会渐进性死亡。哺乳动物的毛细胞在其出生时发育已完成，不再增殖。各种外周听觉系统的损害因素如氨基糖甙类药物、抗肿瘤药（顺铂）、强噪声等可导致毛细胞不可逆性死亡，缺乏靶源性因子支持的听觉神经元继而逐渐发生变性坏死[5，8，15]。外源性给予神经营养因子可减少继发于毛细胞缺失后的听神经变性。对离体培养的螺旋神经节，加入外源NTFs能增加神经突起生长[3，6，8]。在氨基糖甙、水杨酸、顺铂所致毛细胞和听神经元损伤的体外实验中，尽管听毛细胞发生完全缺失，外源性给予BDNF、NT-3仍能保护听神经元，增加其存活，增强功能可塑性[4，5]。对强声损伤动物模型，耳蜗内灌注BDNF、GDNF可有效保护听力，减少螺旋神经节变性[7，15，16]。
基因治疗感音神经聋的技术及原理
基因治疗(genetic therapy,GT)是指在体细胞中转入具有治疗价值的新的遗传物质。基因治疗早已用于治疗许多疾病，包括肿瘤、病毒感染、心血管和中枢神经系统退行性致死性病变。由于耳蜗结构的特殊、精细和一直缺乏有效的靶基因用于听神经元的损伤及获得性的和遗传性的听觉疾病的治疗，基因治疗在耳科学的应用研究起步较晚。Lalwani等[9]进行了基因物质直接进入外周听系的可行性研究，从而开始了对神经性聋基因治疗的探索。他使用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为转染载体，Hartley豚鼠作动物模型，在耳蜗内成功地导入了外源基因。
一、基因载体的选择与构建
选择合适的载体系统是基因治疗的关键之一，借鉴病毒对哺乳动物细胞具有感染性，人们构建了各种有效的病毒转基因系统。目前在内耳疾病治疗中使用较多的转基因载体主要有：腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)、腺病毒(adenovirus,AD)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)。
腺相关病毒作为载体有许多优点：对人和动物无致病性，宿主广泛，可以整合非分裂细胞且比率高，整和稳定可传150代。由于AAV的这些优点而被选作基因载体介导基因入内耳。Lalwani[9]等构建了含有报告基因β-Gal的重组AAV，重组子含有质粒pTR-MLPβ基因组，此质粒含有大肠杆菌β-烯醇化酶（β-galactosidase, β-Gal）基因、腺病毒晚期启动子2、野生型AAV末断重复序列。将携带β-Gal基因的重组AAV105个颗粒通过微渗透泵导入基底回鼓阶外淋巴。由病毒载体导入的基因在耳蜗内能够得到充分表达。2周后用原位免疫组化法检测，在灌注耳蜗中，许多组织均表达β-Gal，包括螺旋神经节(sprial ganlion,SG)、螺旋缘、毛细胞、螺旋神经节细胞(sprial ganlion cell,SGC)，在血管周区域特别强。但包含蜗管的血管纹选择性无染色。尽管感染的组织类型无特异性，但螺旋韧带、螺旋缘表达最强。在对侧耳相同组织中有较弱的染色。除了局部置管创伤外，耳蜗组织细胞结构完整，无感染炎症，内淋巴无水肿。实验结果证实AAV可有效地将外源基因导入内耳并在听神经元及其靶区毛细胞和支持细胞表达[9，17]。
腺病毒作为基因转导的载体亦用于耳聋的治疗。腺病毒可以感染非分裂和可分裂细胞，这对非分裂的内耳细胞有利；易于增殖和纯化、滴度高；感染时基因组不整和进入宿主染色体而相对安全；腺病毒重组稳定，较少发生序列丢失；重组的腺病毒载体早期转录区（E1-E3区）基因删除可使表达容量增大而不影响病毒包装。Raphael等[10]将重组腺病毒携带报道基因LacZ（AD-LacZ）由圆窗膜注射入鼓阶，LacZ在耳蜗内多种细胞内得到表达，其中间皮细胞最为丰富。Weiss等[18]将AD-LacZ感染后的成纤维细胞移植进入外淋巴，2d后观察到LacZ基因的表达。Yagi等[19]将腺病毒携带的GDNF基因从圆窗膜注射入鼓阶，GDNF基因在蜗内得到表达并发挥作用。
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)对非分裂细胞具有天然亲和力，感染具有向神经性，可在神经细胞内呈隐性感染，使用复制缺陷型1型单纯疱疹病毒（HSV-1）载体可将外源基因转染至神经元；早期转录E2区的删除不影响螺旋神经节的生长。通过基因工程构建携带报道基因LacZ的HSVlac能转染内耳多种细胞[11，12]。携带BDNF cDNA的HSV-1载体HSVbdnf和HSVbdnflac扩增子质粒，HSV扩增子包装为在IE3基因删除的辅助病毒的IE3序列区域放置bdnf+/-lac基因。HSVbdnflac扩增子质粒，HSV扩增子包装为在IE3基因删除的辅助病毒的IE3序列区域放置bdnf+/-lac基因。HSVdbnf含有3部分：①转录单位含有HSV-1 IE4/5启动子、BDNF cDNA、SV40多聚腺苷酸；②HSVbdnf增殖所需的2个序列(HSV-1 DNA复制起始点和HSV-1包装点)；③大肠杆菌DNA增殖序列，可含有β-lactamase基因供选择。HSVbdnflac是在HSVbdnf增强子BDNF cDNA序列后加上内核糖体进入点(internal ribosome entry site,IRES)序列、大肠杆菌β-Gal基因伴其后。用HSVbdnf和HSVbdnflac感染Vero细胞系36h，反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptive-polymerase chain reaction,RT-PCR)法BDNF探针可以检测到BDNFmRNA。将HSVlac注射入豚鼠耳蜗，4周后免疫荧光染色可见大部分螺旋神经细胞有LacZ的定位。用HSVbdnflac、HSVlac扩增子感染NIH 3T3细胞，β-半乳糖苷酶(X-Gal)染色，HSVbdnf增加MG87 trkB（含trkB基因的成纤维细胞）的存活，HSVbdnf感染已建立的BDNF反应细胞系PCl2trkB（含trkB基因的PC12细胞）24h能促进神经突起的生长。HSVbdnflac感染螺旋神经节培养物5d，神经突起长度较对照组长。这些均表明HSV携带的基因可在神经细胞和非神经细胞中表达产生生物作用[11]。耳蜗内灌注HSVbdnflac4周的CBA/6J大鼠的神经元胞体轴突均有BDNF的染色[15]。
二、重组基因的导入方式
从哺乳动物和人类的耳蜗解剖特点，耳蜗组织结构因血迷路屏障的存在而与周围结构相对分隔，形成独立的微环境，耳蜗内外淋巴系统可使微小颗粒易于扩散而均匀分布，内耳窗膜结构、骨壁造孔均可提供外源性活性物质导入途径。上述特点使导入的载体颗粒和转基因病毒能在局部发挥作用而不致扩散。Brown等[22]描述了在圆窗龛打孔置微导管，连接微渗透泵将药物注射入鼓阶，Lalwani等[9]用此方法将重组含有β-Gal基因的AAV经圆窗龛导入；Weiss等[8]将AD-LacZ感染的成纤维细胞移植进入外淋巴，Staecker等[15]在耳蜗基底回打孔，微导管鼓阶内直接注射HSVbdnf；Yagi等[19]经圆窗膜直接注射重组的腺病毒颗粒ad-GDNF入鼓阶外淋巴，并证实圆窗膜上的细小打孔对听力无影响，单位点的接种就能使重组颗粒通过耳蜗液扩散到整个耳蜗；Yamasoba等[23]从内淋巴囊注射AD-LacZ观察到耳蜗内有报告基因的表达。总之，耳蜗的结构可以适应外源基因的导入，病毒载体携带的外源基因可直接导入鼓阶外淋巴，并在整个耳蜗内广泛分布并表达。
三、基因治疗的安全性
由于耳蜗骨壳和血迷路屏障的存在，使耳蜗成为一个相对独立的微环境，外源病毒的导入不易扩散；外源基因在局部被转化和表达，无身体其它部位扩散的危险；使用的载体病毒均为复制缺陷型病毒，可防止病毒感染而引起的耳蜗结构和功能异常；转基因不整合入宿主细胞染色体而相对安全；载体病毒不感染耳蜗血管纹，对耳蜗电位无影响[9]；在良好的操作条件下，被注射耳无炎症反应，无内淋巴水肿；耳蜗底回造孔、圆窗膜造孔、圆窗龛造孔置管等介入方法对耳蜗组织结构和听力无明显影响[9，19，22]。Carvalho等[24]认为经鼓室途径切开，耳蜗内给药对动物的听力（如听性脑干反应）无影响。以上结果均证明GT用于感音神经聋是安全可行的。
基因治疗研究的某些进展
一、治疗基因转导对离体初级听觉神经元的作用
螺旋神经节神经元(sprial ganlion neuron,SGN)的存活需要外周和中枢靶细胞的支持，离体的SGN由于缺乏这种支持作用而逐渐出现变性坏死。Geschwind[11]对离体的SGN用1×104个HSVbdnf lac感染颗粒(infectious particles,ip)共同培养4h进行基因转染，感染5d后用抗神经丝蛋白免疫染色检测，神经突起的长度与同样培养条件下100μg/L的BDNF产生的营养作用相同，提示基因治疗对于继发于靶源性营养因子缺乏的螺旋神经节神经元变性有保护作用。
二、耳毒性药物聋的基因治疗
在氨基糖甙类抗生素导致的内耳损害动物模型中，Staecker等[15]在用新霉素小鼠蜗内注射后即刻将2×105个HSVbdnflac ip直接注入。4周后，对照组新霉素导致内毛细胞和外毛细胞完全损坏，血管纹严重破坏，继发性引起SG变性。HSVbdnflac治疗组的SGC存活率94.7%，SG形态保持完整，免疫组化显示SGN中有BDNF的合成和吸收，实验证实转基因用于治疗氨基糖甙类抗生素的耳毒性损害、保护初级听神经元的完整性具有重要价值。同时显示HSV转基因治疗表达的时间较长。
Yagi等[19]用5×107个ad-GDNF从豚鼠圆窗膜注射入内耳后4d，用150mg/kg卡那霉素皮下注射致聋。在基因治疗组动物听阈（ABR）较对照组明显降低；其内毛细胞、外毛细胞的缺失亦少。实验显示转基因治疗具有确切的听力保护作用。
前景与展望
在转基因用于治疗感音神经性聋的研究中，尽管已经构建了病毒载体系统并将其成功地应用于动物实验，取得了可喜的成果，但仍存在一些缺点和问题有待解决。
在转基因载体方面，首先由于目前多选用病毒载体系统，可能仍有部分病毒蛋白表达，具有一定的免疫源性，这就有可激活内耳的免疫反应，而导致转基因表达的封闭；其次，现有的转导基因是由病毒启动子启动，无组织特异性，在内耳的组织中广泛表达，有可能产生过度表达而致目前尚未发现的副作用，再者，如何构建能对内耳细胞特异性感染的载体将对保证基因治疗的成效有重要作用。因此，今后将研究如何利用其他药物控制病毒启动子或者用组织特异性启动子代替病毒启动子，在疾病的整个过程中实施更长而稳定的表达。
在基因导入的技术方面。圆窗膜注射、窗龛骨质造孔注射都只能实现一次性导入；微泵植入虽然可以维持一段时间，但微泵的使用仍受时间限制；通过对基因载体的生物包裹和微囊化将有可能实现长期控释给药。
在治疗性目的基因的选择方面。目前感音神经聋的基因治疗研究多在获得性聋中进行，今后人们将考虑如何选择更多的具有临床实际价值的基因（如抗氧化基因、抗衰老基因等），以及开展对先天性聋的基因治疗。
感音神经聋的基因治疗研究在动物体内进行了一些有益的尝试，构建的携带神经营养因子mRNA的病毒载体，成功地导入内耳细胞并在细胞中获得表达，在体内产生明显的生物活性。但在获得更多的、疗效显著的可利用基因，构建特异表达的载体和靶向性基因，通过基因调控实现长期高效表达等方面仍有待深入。相信在不久的将来，基因治疗感音神经聋的设想将会成为临床应用的现实。
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（摘自中华耳鼻咽喉科杂志2001年12月第36卷第6期）
